制作分析酶类

Microbes  At Work

姜联合  编译

酶类是所有生物体自然产生的一种蛋白质，作为催化剂，它们能将大的复杂的结合物分解为较小的因子，从而能在机体中更容易被利用。日常所知的洗衣液、胰岛素等都是酶类的一种，食品、药品、化妆品都有酶的影子，那么酶是怎样产生的？又有哪些类别，都应用在哪里呢？一起来制作一个生物反应器，学习检测分析酶类的方法。

1 背景知识

酶类是所有生物体自然产生的一种蛋白质。作为催化剂，它们能将大的复杂的结合物分解为较小的因子，从而能在机体中更容易被利用。同样，大量的复合物需要小分子酶类来分解。

根据酶类分解的物质对酶进行分类。

例如，纤维素酶能够将纤维素分解为单糖。当处于合适的温度和pH值的时候它们才具有活性，根据这些特点来考虑酶类是否能运用在商业中，商业上使用的酶类都是从生物反应器中的细菌和真菌体内分离得到的。

生物反应器是一个能够繁殖大量微生物来生产所需的产物的一个大容器。所需的产物可以是医药行业所需的蛋白质，如糖尿病患者所需的胰岛素；也可以是工业上所需要用来软化纸张的，制作奶酪的，或者是让蓝色牛仔服褪色；也可能是家庭所需的如用于软化肉类的蛋白质酶和洗衣液。生物反应器必须包括以下条件：首先，必须能够被完全灭菌；其次，能够提供一个微生物繁殖并产生大量代谢产物的环境；有一个进气口和一个排气口，有一个加样口，以及一个安置测量电极的路径。影响生物反应器效率的因素包括：培养物的纯度、使用的介质、温度、pH值、溶氧量和二氧化碳含量。

蛋白酶是一种能够将明胶这类物质分解的酶类。

过氧化氢酶能分解过氧化氢：H2O2→2H2O + O2

2    实验目的

1） 描述能够影响微生物生长和代谢产物成分的因子；

2）掌握检测现有酶类的方法。

3 装备生物反应器

3.1  实验材料

卫生纸；5L 10%消毒液；5L 的桶；1.25L 的饮料瓶（空的并且洁净）；玻璃棒或者钝探针；酒精灯；1米洁净的水管；气石；锋利的剪刀或刀片；硅胶塞；15L 无菌水；橡皮圈；大纸夹镊子；烧杯；液体酒精；装在密封瓶子里的消毒棉（用铝箔纸封口，在烘箱中160℃2小时灭菌）；空气泵。
   

3.2实验步骤

1） 用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭你的实验台；

2） 用酒精度加热钝探针或者玻璃棒的一端，在饮料瓶的上端打出等距的3个孔，每个孔将装上干净的水管；

3） 用剪刀或刀片将水管切成以下长度：

排气管 12cm、上样管 30cm、充气管 50cm；

4） 将每个水管插到对应的孔中，如右图

a、      排气管应将一半以上插入瓶中；

b、      上样管应插入到接近却不碰到瓶底；

c、      充气管应该解除到瓶底；

5） 将接通空气的管子与充气管的末端接在一起；

6） 用硅胶塞将管口密封。可用橡胶圈将管子固定。

放置24--48h；

7） 带上手套；

8） 用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭你的实验台；

9） 在烧杯中加入液体酒精，并将镊子浸没其中15；

10）      将桶里加入10%消毒液，将瓶子和瓶盖浸没在其中至少10 min；

11）      倒掉消毒液；

12）      用冷的无菌水冲洗3次；

13）      盖上瓶盖，用夹子夹住折过来的上样管达到密封效果；

14）      用灭菌的镊子将消毒棉轻轻塞入进排气管和充气管的末端，并将充气管与空气泵连接。

4 生物反应器接种

4.1实验材料

天平；2个称量盘；15g 糖；1g 酵母膏；

350mL 蒸馏水；加热板；400mL 带塞子的锥形瓶；漏斗；1L 10%消毒液；3L 无菌水；pH试纸或者pH计；0.1M HCl；

1袋（7g）活性酵母（酿酒酵母）。
   

4．2实验步骤

15）      用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭你的实验台；

16）      将350mL蒸馏水加入锥形瓶；

17）      用天平称取糖与酵母膏；

18）      将糖和酵母膏加入锥形瓶并加热至沸腾；

19）      测量溶液的pH值，如果高于5.4，就慢慢叫人盐酸让pH值降至5.4；

20）      煮沸15分钟，然后盖上盖子，冷却；

21）      用桶中稀释的消毒液对漏斗消毒，然后用无菌水清洗3次；

22）      快速打开瓶盖，将漏斗插入，将肉汤灌入生物反应器；

23）      盖上盖子并开始充气，这便能产生一个正压，使得其他的微生物很难进入；

24）      再次将盖子打开，插入漏斗，并加入一袋酵母粉；

25）      将盖子盖紧。

5  分析酶的产量

5.1 实验材料

10mL 注射器;消毒棉；3% 过氧化氢液；

移液管；带盖子的瓶子（比微量离心管大的）；2个显微镜载玻片；1个盖玻片；

微量离心管；秒表或计时器；在培养皿中倒入5mm厚的含有红色食用；色素的明胶；

滴管；2根试管；试管架；将0.33g肉类软化剂溶解在10mL水中；透射光学显微镜（物镜放大倍数为40倍）；100mL 10%消毒液；100mL 量筒.

5.2 实验步骤

    分析从接种的那天及其后三天分别进行。必须每天搅拌样品数次。

1. 打开上样管的夹子，接上10mL注射器并抽取大约3mL发酵液弃去；

2. 抽取10mL发酵液。夹上夹子，取下注射器并塞上消毒棉。

6  过氧化氢酶分析

1. 向微量离心管中加入0.5mL发酵液；

2. 加入0.5mL 3%的过氧化氢溶液；

3. 立刻盖上离心管的盖子然后置于一个带有盖子的容器中；

4. 如果产生大量的气泡则说明含有过氧化氢酶；

5. 记录下从开始到产气量达到最高的时间，如果超过半个小时即可停止分析；

6. 将用过的离心管放入装有消毒液的桶中。

7 蛋白酶分析

1. 用吸管从含有明胶的培养皿中取适量明胶放入一个试管中；

2. 重复上述操作，将明胶放入第二个试管；

3. 在第一根试管中加入1mL发酵液；

4. 在第二根试管中加入1mL肉汤；

5. 记录下溶解明胶块所需的时间；

6. 将用过的试管放在装有消毒液的桶中。

8 显微镜观察

1. 在载玻片上滴1--2滴培养物，盖上盖玻片；

2. 将用过的注射器放入装有消毒液的桶中；

3. 调节透射显微镜至低倍镜；

4. 将载玻片放在显微镜载物台上，画下并标记出你所观察到的；

5. 将显微镜调节至高倍镜，画下并标记出你所观察到的；

6. 将用过的玻片放在装有消毒液的桶中。

7. 思考题

8. 微生物在需氧的液体环境中生长需要哪些必要的条件？提供氧气和搅拌

9. 为什么在厌氧环境微生物不能产生酶类？酶的产生是依赖ATP的合成代谢途径，而氧气形成是合成酶所需ATP的前提。

10. 举例说明微生物产生的酶类和蛋白质在工业上的应用。答案不唯一，在背景中提到过。

10  现实生活中生物反应器的应用

生产酶类：酶类被广泛用于食品行业、制造业、制药业和家庭使用的化学物品。

 参考文献

1. United-Tech, Inc. 2004. Explaining bacteria & enzymes. Accessed on 22 June 2009. http://www.united-tech.com/bacteria.html

2. Frame, K. (Ed.) 2002. Shoestring Biotechnology. Virginia: National Association Biotechnology Teachers