2016年12月2日，国际顶级期刊Science刊登了北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室主任周德敏教授/张礼和院士课题组题为“Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication—Incompetent Virus Vaccines”（制备复制缺陷的活流感病毒疫苗）的突破性研究进展。北京大学周德敏教授实验室的博士研究生司龙龙、徐欢为共同第一作者。

这一研究成果在改变现有的疫苗研发、生产体系方面具有极大地潜力。通过在天然病毒株遗传序列中引入过早终止密码子，使得改造后的病毒在普通细胞中丧失复制增殖能力，但却保留完全的感染活性。研究者利用这种完全活性的病毒制作疫苗，能够有效诱发强大的体液、粘膜以及免疫T细胞介导免疫反应应对抗原性病毒，甚至能中和已受感染者体内存在的病毒株。这种疫苗技术有望成为一种应对几乎所有病毒的普适性方法，特别是全球众多致命性病毒。

工作原理：将活体病毒作为疫苗

在保留病毒完整结构和感染力的情况下，使流感病毒由致命性传染源变为了预防性疫苗。这一技术不仅使疫苗研发不再复杂，而且摆脱了对病毒生物学知识获得的依赖，并适用于几乎所有病毒。多数评论认为，这一发现颠覆了病毒疫苗研发的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“现在的疫苗研发与生产技术复杂，而且是不通用的，比如说做流感疫苗的技术不能用在其他病毒的疫苗上面。”司龙龙说，这种病毒个体差异导致的疫苗研发技术的复杂性阻碍了其发挥更好的作用。

而周德敏教授的课题组所取得的技术突破，就是使得疫苗的研发技术获得普适性，同时增强疫苗的效用。周德敏说，课题组以流感病毒为模型，发明了人工控制病毒复制从而将病毒直接转化为疫苗的技术，即“在保留病毒完整结构和感染力的情况下，使流感病毒由致命性传染源变为了预防性疫苗”。这一技术不仅使疫苗研发不再复杂，而且摆脱了对病毒生物学知识获得的依赖，并适用于几乎所有病毒。多数评论认为，这一发现颠覆了病毒疫苗研发的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“以（甲型）流感病毒为例，我们在改流感病毒中的信使RNA中引入了一个‘终止密码子’，并保留病毒的完整结构。这样，保留了感染性的病毒进入生物体后，可以激活生物体细胞的全部免疫反应；但由于终止密码子的存在，病毒无法进行蛋白质翻译，因而失去复制能力。”周德敏说。

周德敏团队利用活体禽流感病毒制作疫苗，并进行了包括小鼠、荷兰猪和白鼬在内的疫苗接种动物实验。病毒入侵宿主后，不会发生复制增殖，却可以诱导集体产生对抗该病毒的免疫能力。

关键步骤：切断病毒的复制程序

在病毒的遗传密码中引入终止密码子，就像是电脑需要执行一个程序，需要各种程序文件，研究人员在其中插入一个终止程序的文件，一旦程序走到这一步，就会停止，复制也就无法进行。

制作疫苗，首先是要阻断病毒强大的自我复制能力。无论是目前常见的灭活疫苗还是减毒活疫苗，最基本的要求就是病毒在进入生命体之后，不能复制或者低水平复制。

同样，该项研究所使用的病毒，也要采取手段切断其复制程序，即通过在病毒的遗传密码中引入终止密码子，使得病毒在进入人体之后，只能发挥疫苗的作用，而不能作为病毒横行肆虐。

据司龙龙介绍，部分病毒是RNA病毒，即它们的遗传物质是RNA，“DNA是双链结构，RNA一般是单链结构，所以RNA没有DNA结构稳定，且RNA复制酶没有校正功能，更容易发生突变，这也是病毒为什么会很快发生突变的原因。”

病毒的信使RNA（mRNA）负责合成蛋白质，其中三个相邻的碱基构成一个密码子，病毒通过密码子的序列合成蛋白质并完成复制。而在这些密码子中，有一类特殊的终止密码子，它们的作用是终止蛋白质的合成，病毒一旦无法完成蛋白质的合成，就无法复制。实际上，一个病毒如果想要完成复制，就像是电脑需要执行一个程序，需要各种程序文件，研究人员在其中插入一个终止程序的文件，一旦程序走到这一步，就会停止，复制也就无法进行。

制作疫苗：通过转基因细胞生产病毒

终止密码子相当于给病毒上了一把锁。想要将锁打开，让病毒恢复自我复制能力，需要三把钥匙同时发挥作用，但在人体中，这三把钥匙都不存在。只有在我们自主研制的细胞系里，病毒才会开启复制开关。

整个研究成果实际上包含了病毒复制能力的整套“开关”程序。关闭程序保证了病毒在进入生物体内不能“作孽”，开始程序则要解决该类活体病毒疫苗的生产问题。

课题组成员，北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室博士后李帅说，早在6年前，周德敏就主持了一个国家973项目——《基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法》，该研究成果的核心部分就是运用了这种改造密码子翻译技术，并将这种技术引入病毒体内改造病毒进而开创了新的病毒疫苗设计体系。

开启已经插入终止密码子病毒复制程序的就是这项“基因密码子扩展技术”。

周德敏说，通过该项技术，建立了他们自主研发的疫苗“生产工厂”——位于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室的病毒包装细胞系，该细胞系被人工改造过，提供病毒复制的必要条件。“终止密码子相当于给病毒上了一把锁。想要将锁打开，让病毒恢复自我复制能力，需要三把钥匙同时发挥作用：非天然氨基酸、与这类氨基酸匹配的转运RNA（tRNA）以及tRNA合成酶。在人体中，这三把钥匙都不存在，因此不会对人体产生负面影响。只有在我们自主研制的细胞系里，病毒才会开启复制开关，从而可以复制出大规模的带有终止密码子的病毒，用以生产疫苗。”

“已经插入了终止密码子的病毒，只有在我们提供的这个条件中才可能完成复制，并且复制之后的病毒仍然带有终止密码子，在生物体内仍然无法复制。”司龙龙说。

新技术用于临床路还很远

中科院病原微生物与免疫国家重点实验室研究人员孟颂东表示，周德敏团队的研究是一种“全新的、前所未有的方法”，为对抗病毒指明了新路。然而，他同时也表示，这种人工改造的病毒有可能发生意外的突变，打破原本对其自我复制性的限制，这将带来不可估量的后果，尤其是RNA病毒本身的极易突变特性带来的风险。

外界的另一个担心是，一旦改造后的病毒与天然株病毒之间发生遗传重组，会不会发生更可怕的事情，至少目前实验来看，这种情况还没有发现，甚至有更为有趣的发现，即被插入了终止密码子的病毒“感染”了天然株的病毒，使得天然株病毒也带有了终止密码子，失去了本身的复制能力。

周德敏对此解释道：“病毒一直在进行重组。我们的活病毒疫苗进入人体后，如果体内同时存在感染的病毒，它们之间会重组，带终止密码子的病毒基因会进入野生病毒的基因中。只需要一个终止密码子，野生病毒就会失去复制能力。如果流感疫苗里设置的终止密码子越多，它们能中和的病毒数量就越多，也就是说药性越强。”在周德敏看来，如果未来爆发大规模的病毒疫情，运用这种方法，人们可以在短时间内生产出大量针对性药物。

“整个研究所带来的是一种理念的变化，首先是多学科的交叉，其次，这里面的多项技术都可能推动各自领域的发展，比如基因密码子扩展技术对于基因药物的研发可能会带来很大的推动作用。”李帅说。

目前，周德敏已经为该技术申请了专利。尽管目前的动物试验十分成功，但周德敏表示，他还不清楚针对该项目的临床试验何时能够得到批准，“因为这是一项全新的研究，政府机构需要对此保持慎重的态度。或许将来的临床试验会出现新的问题，现在还难以判断。”

1. 通过在病毒RNA中插入终止密码子（UAG），改造病毒。

2. 这枚细胞是研究组通过基因密码子扩展技术所制造的细胞系的特殊细胞，当病毒的复制程序打开，并且阅读到终止密码子位点时，细胞会提供人工氨基酸UAA，让程序继续进行，完成复制，从而可以复制出大规模的带有终止密码子的病毒，用以生产疫苗。

3. 另一方面，在人体正常细胞内，由于缺乏非天然氨基酸、与这类氨基酸匹配的转运RNA（tRNA）以及tRNA合成酶，病毒无法完成复制，即不会对人体产生负面影响。

4. 插入了终止密码子的病毒与野生株病毒进行基因重组之后，会产生同样携带终止密码子的病毒，其复制能力也会丧失。（记者 王腾腾）