8月15日，阿尔伯尼生物医学奖宣布将2017年奖项授予5名在基因编辑领域做出先驱性贡献的杰出科学家，80后科学家张锋成为历史上第二位获得此奖项的华人学者。他最著名的工作是基因修饰技术CRISPR-Cas9的发展和应用，率先获得了美国专利，并被视为诺贝尔奖的热门人选之一。 

　　阿尔伯尼生物医学奖获得者张峰（图片来自网络） 

　　那么CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，它为何能够获得如此青睐？ 

　　CRISPR/Cas9技术 

　　CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。所谓“基因编辑技术”，就是能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入的一项技术。 

　　与前两代技术相比，CRISPR/Cas9具有成本低、制作简便、快捷高效的优点，于是它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 

　　CRISPR/Cas9分析系统（图片来自网络） 

　　CRISPR/Cas9系统的工作原理 

　　那么，这么厉害的技术，是如何操作的呢？ 

　　在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。 

　　1.“记录”入侵者档案 

　　其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。 

　　CRISPR序列示意图（其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列） 

　　病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。 

　　当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。 

　　2、打击二次入侵者 

　　当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。 

　　图片来源网络 

　　正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。 

　　CRISPR/Cas9技术在基因敲除中的实现过程 

　　如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1，向导RNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。 

　　对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。 

　　CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理图（绘图肖媛） 

　　而DNA片断的插入或定点突变的实现，只需在此基础上为细胞提供一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。 

　　CRISPR/Cas9技术插入新基因原理图（绘图肖媛） 

　　CRISPR/Cas9技术的应用 

　　利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，科学家们做出了许多成果。比如，北京希诺谷生物科技有限公司用此技术培育出比格犬“龙龙”，它成为我国首例完全自主培育的体细胞克隆犬，也是世界首例基因编辑克隆犬。 

　　世界首例基因编辑克隆犬“龙龙”（图片来源科技日报） 

　　除此以外，来自美国、中国、丹麦研究机构的科学家凭借此技术成功克隆出世界上第一批不携带活性内源性逆转录病毒（PERVs）的猪，克隆猪将来可以满足人类器官移植的需要。 

　　第一只不携带活性内源性逆转录病毒的克隆小猪（图片来自网络） 

　　随着对CRISPR系统认识的加深，实验设计的优化改造，我们相信CRISPR/Cas9以及其衍生技术终究会带来一场科学史上的巨大变革。期待在不久的将来，CRISPR/Cas9所带来的巨大转变必将能够惠泽万家，到时候属于它的诺奖终将到来。