RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。定义

目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同.如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞，能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失，属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence,PTGS)。

各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。

RNAi的发现早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达，但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neurospora) 中发现了相似现象，只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA 作为对照，也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA 干扰。 过去认为，哺乳动物细胞中不存在RNAi 现象，因为较长的dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干扰素) 生成，并激活STAT 途径参与的PKR(dsRNA 依赖性激酶) 的转录，同时dsRNA 本身与PKR 结合也能令其激活，继而磷酸化翻译起始因子eIF2a 使之失活，导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面，dsRNA 又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′，5′腺苷合成酶，生成 2′，5′腺苷酸，激活非特异性的RNA 酶L,发生非特异性的RNA 降解效应。现在发现，只要dsRNA 短于30bp,就不会促发干扰素效应，同时又能特异性地降解mRNA,引起基因沉默，说明dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用，为以后的基因治疗等RNAi 应用领域提供了新的研究方向。

RNA的干扰最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。

有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。

另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。

RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。

总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

反义技术经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNAi的特点转录后水平的基因沉默

较高特异性：能够非常特异的降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA

高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制

可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代

分析RNAi的效果RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR，定量PCR，或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。 与传统的基因敲除等基因沉默技术相比，RNAi技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道也日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。不仅如此，RNAi技术还将可能成为研究细胞信号传导通路与基因治疗的新途径。

RNAi的作用机制近年来研究发现，干扰性小RNA( small interfering RNA,或short interfering RNAs,siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸( nt ) 的特殊双链RNA(dsRNA) 分子，具有特征性结构，即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性； siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外，每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基RNAi 的主要过程是，dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干扰性小RNA ( siRNA),由siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 细胞中dsRNA 可通过多种途径形成，如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义RNA ;病毒RNA 复制中间体；以及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA. 现已初步阐明RNAi 的作用机制. RNAi 的第一步是，dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在Arabidopsis,C. elegans,Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物. RNAi 的第二步是，由siRNA 中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA 诱导的沉默复合体( RNA induced silencing complex,RISC),由RISC 介导切割靶mRNA 分子中与siRNA 反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达作用. RISC 由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性等. 线虫C. elegans中的MUT7(一种RNase D样蛋白) 可能是一种3′5′外切核酸酶. 此外，PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分，如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等。

RNAi的应用前景RNAi 技术中的相关问题主要涉及以下几点：

(1) dsRNA 序列的选择dsRNA 主要选自已知的cDNA 的开放阅读框架(ORF) 中的基因区域。为防止mRNA 调控蛋白对RISC 与靶RNA 结合的干扰，应避免选择包括：1) 起始密码子下游或终止密码的50～100 核苷酸位置以内的区域；2) 5′或3′端的非翻译区域；3) 内含子区域。此外，序列选择时也应避开多聚鸟苷酸序列区( ≥3 个),因为这样容易形成四聚体结构，抑制RNAi 作用。选择与靶mRNA 上序列互补的21～23 个核苷酸长度的片段，以AA 开头为佳，因为此法能简化dsRNA 合成过程，降低成本，而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外，尽量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %～55 %最佳),高GC 含量能明显降低基因沉默的效应。选择前可以搜索BLAST数据库，保证无其他与靶基因同源的基因存在，避免引起对其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均对RNAi 敏感。为确保靶基因表达的有效抑制，最好同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRNA ;而且，标记dsRNA 正义链的3′端对RNAi 现象并没有影响，现有的实验尚未发现mRNA 的二级结构对RNAi 有任何显著的影响。目前，RNAi 技术主要以哺乳动物细胞为对象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳动物细胞中会引起干扰素样效应，导致非特异性反应。因而直接选用其下游的产物分子siRNA 来代替，达到基因研究的目的。

(2) dsRNA 的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简单生物，如单细胞生物等，可选用电穿孔的方法； 较复杂生物可选用dsRNA 微注射入生殖细胞或早期胚胎，线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法，与微注射相比，RNAi 效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。若使用的是化学法人工合成的siRNA(正义链和反义链),还要经过退火过程，以双链的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体，通过转导或转染途径，在细胞内以DNA 为模板，利用RNA 聚合酶Ⅲ，转录为siRNA(直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构),也能产生较明显的RNAi 效应。最近，又有一种新的导入方法，就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内，观察RNAi 在活体生物模型而不是培养细胞上的基因沉默效应，但观察到的siRNA 的半衰期较短，而且由于使用了高压的外力，过程较复杂，限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而Pachuk 等则提出了肌注的方法，将针对IL－12 的siRNA 的质粒表达载体导入小鼠体内，得到的RNAi 效应更持久。

(3) 发夹样结构的siRNA实验证明，发夹样siRNA 能延长在细胞内的作用时间。此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成。但通常回文结构不易获得，也可用头碰头的对称序列来代替。转录发夹样siRNA 的模板必须与载体转录启动子紧密相连，而且尽可能有最短的多聚腺苷酸尾巴，这样才能诱导高效的RNAi 效应。Paddison 等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA (500bp 左右),而不会引起RNA 非特异性的降解。这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能提供了新的途径。

RNAi 的应用领域及前景：RNAi 是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA 分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA,封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过RNAi 研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA 与靶mRNA 序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物———Vitravene。RNAi 技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20 种基因功能进行了“敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101 对HIV 在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAi 来诱导细胞的胞内免疫，产生抗病毒效应，尤其是针对RNA 病毒。对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsRNA,减少它对dsRNA 的抵抗。Maen 等也应用RNAi 技术成功地阻断了MCF－7 乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp21 的功能。RNAi 技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展，还有可能设计出RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。

siRNA的制备方法化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

体外转录以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

体内表达前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。

最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。

不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

siRNA表达框架siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。

最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子

不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）

利用病毒进行RNA干扰由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因的抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后的效率只有9%，可见如何提高siRNAs的导入效率非常重要。基于RNAi病毒载体构建、包装、浓缩等技术，是解决难于转染细胞（特别是神经细胞、悬浮细胞、干细胞）和In vivo实验的最佳方案。常见的RNAi病毒包括慢病毒和腺病毒1。

应用RNAi在探索基因功能中的应用人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。

RNAi在基因治疗领域中的应用RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

RNAi在整形外科领域的应用前景已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。

最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。

瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βII型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。

病毒性疾病的治疗加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

遗传性疾病的治疗美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。

肿瘤病的治疗肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。

在植物学中的应用Napoli等将1个查尔酮合成酶基因(chs)置于1个强启动子后导人矮牵牛(Petunia hybrida)，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制(co-suppression)。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurospora crassa)中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生PTGS的个体中同源转录确实存在，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致PTGS，但对非转基因植株却无效。Cogoni等证实PTGS由一种可扩散的反式作用分子所介导。

相关知识Argonaute (AGO)：一类庞大的蛋白质家族，是组成RISCs复合物的主要成员。AGO蛋白质主要包含两个结构域：PAZ和PIWI两个结构域，但具体功能现在尚不清楚。最近的研究表明，PAZ结构

RNAi实验流程

域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域，对于siRNA和目标mRNA相互作用，从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程，是必不可少的。同时，不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。例如，在人当中，AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程；而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。

Core RISC：是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。

Dicer (DCR)：是RNAase Ⅲ家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。

Holo RISC：是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物（80S）。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员，RLC成员，和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在，表明了RISC组装不是孤立的，同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系，很可能借此调控生物体的生长发育过程。

Microprocessor：一种核内的复合物，主要由Drosha和Pasha两者组成，在miRNA的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。

MicroRNA (miRNA)：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。

RISC loading complex (RLC)：是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋，为以后的RISC组装作好铺垫。最近，siRISC loading complexes （siRLCs）在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋；R2D2部分是非对称性的感受器，为RISC组装调整好siRNA的方向。miRISC loading complexes （miRISCs）的研究尚未报导，因为它的过程更为复杂，而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。

RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS)：是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA和AGO蛋白质，通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。

RNA-induced silencing complex (RISC)：一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。RISCs（无论siRISC还是miRISC）包括两种类型：切割型和不切割型。现在的研究表明，RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。

Slicer：在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。