羧基的保护

在肽合成中，除了羧基组分的羧基需要活化来进行接肽以外，其他的不反应的羧基都存在一个需要保护的问题。羧基被保护后，除了可以防止在接肽反应中不需要反应的羧基被活化带来副反应以外，还能使氨基组分的氨基不能同羧基形成内盐而完全游离出来以便于同羧基组分反应形成肽键。当用活化酯法和混合酸酐法接肽时，可采用将氨基组分的羧基同有机碱成盐的形式来进行反应。由于羧基自由的肽在有机溶剂中的溶解度比酯的溶解度要小，从而给接肽反应和产物的纯化分离带来不便。

肽键生成的方法肽键的形成是氨基在羧基上的亲核取代反应，涉及一个四面体中间体，然而，在室温下，羧酸与氨或胺的反应产物是铵盐而不是酰胺。因此，羧基组分必须在肽键形成前活化。此外，肽缩合反应必须在温和的反应条件和室温下进行。目前，形成肽键最常用的方法是碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、迭氮物法等1。

活化酯法1951年魏兰德(Wieland)和谢飞(Shoefr)采用硫代苯酯，许为彻(Sehwyzer)1955年采用氰甲酯提高了酯的活性，从而可用于肽的合成，但比较成功的要算波丹斯基(Bdenaskzy)1955年发展的对硝基苯酯。N-保护氨基酸对硝基苯酯的活性很好，能在室温条件下很快的与氨基组分反应得到很好的接肽产率。稍后，肯纳(Knener)等人也发表了关于用取代苯酯作为活化酯报道。除了取代苯酯或硫代苯酯以外，可以用作为活化酯的还有N-保护氨基酸与烯醇类化合物形成的酯，与杂环上羟基形成的酯以及连接在固相载体上的活化酯等。活化酯的优点在于所用的N-保护氨基酸活化酯很多都能分离纯化出来得到结晶的纯品，而且比较稳定，能够放置保存2。其与氨基组分缩合的反应速度，虽不及混合酸酐法和DCC法快，但也并不很慢，而且还可以加入适当的添加剂以催化反应的进行。在用活化酯法接肽时，氨基组分的末端羧基可以是保护的也可以是不保护的，对于一些侧链功能团，如羟基、酚基等也并不要求一定要保护。这对肽合成方案的设计来说，就给了很大的方便。同酰氯和混合酸酐法相比，活化酯接肽的反应速率是比较慢的，随着肽链的增长，溶液中反应物浓度的降低，反应速度将更慢。

碳二亚胺法(DCC法)在多肽和蛋白质合成中，DCC法应用较广泛。在多肽合成中最常用的是，N,N-二环己基碳二亚胺，简称DCC。DCC活化羧基的反应机理：N-保护的氨基酸同DCC反应首先生成活化中间体O-酰基脲，它实际上也可以看成是一种活化酯。此活化中间体与氨基酸酯反应则生成肽酯，并释放出一分子的N,N-二环己基脲(DCU)。由于DCu在大多数有机溶剂中的溶解度很小，因而可以过滤除去，但残留在溶剂中少量的DCU有时会混在连接产物中很难完全除尽。这时若采用很容易用酸洗除去水溶性碳二亚胺来代替DCC则可避免这个麻烦。

肽键可以通过O-酰基脲直接同胺反应或者先经过对称酸酐再同胺反应生成。但究竟主要是通过哪条途径，则同反应条件有关。在液相接肽反应中，可能主要是通过O-酰基脲同胺的直接反应。

混合酸酐法混合酸酐法是50年代初期发展起来的。开始是用酰基氨基酸同二苯基磷酸形成的混合酸酐，然后是用同二苄基磷酸形成混合酸酐以及同苯甲酸形成的混合酸酐。当苄氧羰基氨基酸同苯甲酸形成的混合酸酐与氨基组分反应时，会形成氨基组分被苯甲酰化的副产物。为了抑制这个副反应，后来还改用了同羧基碳原子上电子密度较高的或空间位阻较大的其他羧酸形成的混合酸酐。另一方面，Wielnad和Boisosnnas则发展了用酰基氨基酸的三乙胺盐与等当量氯甲酸乙酯反应形成混合酸酐，它同氨基组分能得到高的接肽产率。而用同氯甲酸异丁酯反应形成的混合酸酐则可以进一步提高产率。这也就是后来成功地广泛用于多肽合成中的混合酸酐法。

迭氮物法在1902年由Curtius建立起来的迭氮物法虽是一个比较古老的方法，但由于它最少引起消旋，而且能在液相法中用于大片段肽的合成，因而直到今天也仍然作为一个片段缩合的较好方法而被普遍采用。在胰岛素、牛胰核糖核酸酶及其S-蛋白(104肽)、胰蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶TI的合成中都曾经采用了这个方法。迭氮法的酰化反应比较温和，在用迭氮物法接肽时，侧链上的羟基、咪唑基和酰胺基可以不要保护，甚至羧基组分的侧链羧基和a-羧基都可以不保护，而得到最少保护基的“赤足”肽。