脱毒细菌主要指运用微生物细菌的某些特性对毒素进行脱毒的过程,脱毒细菌大多属于益生菌,可脱除赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等常见毒素,脱毒机理主要包括吸附和降解两种方式。
脱毒细菌脱毒机理细菌脱毒机制大致分为两种类型:通过吸附作用方式的脱毒和通过降解作用方式的脱毒。
与硅酸盐、黏土、活性炭等物理吸附不同,细菌对毒素的吸附效率不受吸附剂的孔径大小和接触面积等化学结构的影响,它依靠自身吸附能力,如细胞壁糖、酸等的作用使菌体-毒素复合物达到稳定状态,降低毒素的生物利用度,使其难以被机体吸收,进而排出体外。但这种吸附没有特异性,仅将毒素吸附在吸附剂表面,且以非共价方式结合形成的菌体-毒素复合物的稳定性易受外界条件的影响,不能从根本上脱去毒性,仍残留在食品中。
已发现多种细菌不同程度降解毒素的产生,这可能与细菌产生的胞外酶有关系,由于胞外酶的复杂性,目前这类酶详细的结构功能研并不深入,有类似功能的酶统称为细菌解毒酶,其对毒素降解的作用位点也有待于更精细的研究与挖掘。以黄曲霉毒素B1(AFB1)举例,根据 AFB1降解的作用位点不同,AFB1的降解作用主要发生在 4个位置:1)香豆素结构中的内酯环部分,通过水解作用生成酚式化合物,使 AFB1转化为毒性较小的化合物。2)呋喃环双键,与核酸和蛋白质等的结合位点,与致癌性、致畸性和致突变性均有很大关系。该双键与 H2O、氢原子等发生加成反应,降低 AFB1毒性。3)环戊烯酮环通过加成反应、取代反应影响 AFB1的毒性。4)苯环上的甲氧基,与羟基、氢原子、醛基发生取代反应,减弱其毒性。同时,AFB1的部分降解产物间可通过取代等反应发生相互转化。
吸附机理应用迄今为止,已经有多种具有吸附能力的细菌被发现。
自然界中有些微生物脱毒方式是与菌体本身的性质如细胞壁成分有关,细胞壁的某种成分或者是结构可以吸附 AFB1,如一些细菌有乳酸菌某些益生菌,是通过形成菌体-毒素复合体发挥作用的。
细菌如乳酸菌的脱毒机理主要是通过细胞壁中 N-乙酰胞壁酸及 N-乙酰葡萄糖胺为主要成分的肽聚糖对AFB1进行物理吸附1。Hernandez-Mendoz等[20]筛选出乳酸菌类细菌干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L30),当在最合适条件下,与毒素作用时,结果对 AFB1的吸附率为 49.2%,经分离检测得到主要是细胞壁产生胞壁酸发挥主要作用,吸附的过程主要是通过形成稳定性良好的毒素—菌体复合物来吸附毒素,随后进行反复水洗实验证明了这个脱毒该吸附过程达到一定程度,吸附作用会降低,出现回返的结果,表明干酪乳杆菌对黄曲霉毒素B1的吸附作用时一个有限制且可逆的。
具有吸附能力的微生物的微生物很多,因为微生物脱毒方法的普遍应用,如今也成为研究的热点话题,迄今为止,已经有多种吸附作用微生物被发现。S. Gratz 等研究发现益生菌 LGG(Lactobacillus rham nosus GG)主要是通过细胞壁的成分发挥作用,经过实验研究表明,主要是因为细胞壁上的肽聚糖成分,它们能特异性结合AFB1,进过细胞实验,有效抑制该毒素被肠道吸收,减缓 AFB1在 Caco-2 细胞中的运输和新陈代谢。
降解机理应用多种细菌对毒素均有降解作用,如嗜麦芽营养单胞菌、短状杆菌、肠杆菌、短波单胞菌、克雷白氏杆菌、橙色粘球菌、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、绿脓假单胞菌、芬氏纤维微菌等被证明可以有效去除 AFB1。
近年来,对于细菌对黄曲霉毒素B1的研究也很广泛,主要研究益生菌的很多,主要停留在研究其机制方面。
中国农业科学院课题组2研究从玉米,水稻和土壤样品中检测了43个用于AFB1还原活性的细菌分离物。在分离物L7中检测到较高活性,鉴定为Bacillus shackletonii。在37℃,72小时后,L7使AFB1,AFB2和AFM1水平分别降低了92.1%,84.1%和90.4%。L7培养上清液比活细胞和细胞提取物降解更多的AFB1;在蛋白酶K和十二烷基硫酸钠的存在下,降解活性从77.9%降至15.3%。将从煮沸的上清液中纯化的热稳定性酶命名为芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶(BADE)。用DEAE-Sepharose色谱法得到9.55倍纯化的BADE,回收率为39.92%,活性为3.85×103 U·mg-1。BADE的分子量估计为22kDa,在70℃和pH8.0时表现出最高的活性,Cu可以提高BADE的活性,Zn,Mn,Mg和Li可以抑制这种活性。BADE是参与AFB1解毒的主要蛋白质。
江苏大学课题组为使用含有香豆素作为唯一碳源的培养基,从土壤样品中分离出能够降解黄曲霉毒素B1的细菌菌株。通过16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌JSW-1,进一步的表征表明,它可以抑制黄曲霉菌的生长,抑制率为58.3%,在30℃孵育72 h后可以降解67.2%的AFB1。分离株JSW-1的黄曲霉毒素B1降解活性主要归因于无细胞上清液,并且发现该活性是热稳定的,但对蛋白酶K处理敏感,表明细胞外蛋白质或酶是导致AFB1降解的原因。
对细菌降解 OTA 方面,研究显示动物的胃肠道微生物通常能有效地降解 OTA,特别是在反刍动物中3。Madhyastha等(1992)研究发现,非反刍动物肠道内的微生物也能影响 OTA 的生物降解率,OTA 的降解率可能与盲肠和大肠中微生物的多少有关。Hwang和Draughon (1994)筛选了 37 种细菌,得到了一株醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),并且发现这株醋酸钙不动杆菌能在乙醇无机盐培养基中将 OTA降解为 OTα。Fuchs等(2008)筛选到 1株可以降解 OTA 的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophi⁃lus) VM20,并且通过人类肝肿瘤细胞微核实验对该菌株的脱毒效果进行了生物学验证。Böhm 等(2000)报道,乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽孢杆菌(Ba⁃cillus)、酵母菌(Saccharomyces)都具有一定的OTA降解能力,但降解产物的结构、毒性以及这些微生物在毒素污染饲料中的实际应用效果都有待进一步研究。
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梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学
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