细胞也有“地图”？

王欣如

你是否曾经思考过以下问题：“我是谁？”“我从哪里来？”“我存在的意义是什么？”从古至今，人类从未停止思考，也从未停止对自身的探索。19世纪末，生物学开始迅猛发展，双螺旋结构的问世让一门新的学科出现在大众面前——基因组学。从此，人类基因组计划诞生。人类基因组计划旨在获得人类全基因组信息，了解人类23对染色体的所有信息。

图1.人类基因组计划

（源自网络）

现如今，人们对于自身以及某一物种的基因信息可以轻松获得。细胞生物学的迅速发展使科学家们开始思考，组成人类的成千上亿个细胞，虽然能够获得基因信息，但是却不知道具体某一个细胞的位置。我们日常使用的地图，可以轻松的找到某一个城市的位置，甚至于其他信息。那人体这一张大画布上，分布了成千上亿的“城市”，如果能将他们绘制成一幅地图，在疾病模型中就可以轻易地知道是哪座“城市”出现了什么问题。于是在“人类基因组计划”告一段落之后，科学家们提出了“人类细胞图谱计划”。

图3.艺术品地图

（图源自网络）

“人类细胞图谱计划”致力于建立一个健康人体所包含的所有细胞的参考图谱，包括细胞类型、数目、位置、相互关联与分子组成等。理想的人类细胞图谱计划应当囊括所有可能的标志物：一个人体中的所有细胞，每个细胞的空间位置，一个人类生命中每一刻的每个细胞，每个人类的细胞图谱的叠加，根据不同健康状态、基因型、生活方式和外界环境加以注释。

揭示空间组织结构的功能和结构之间的异质性是生物学研究的基础。这一需求推动了很多空间转录组研究技术的发展，从早期使用荧光原位杂交的方法到目前应用最为广泛的10x Genomics Visium技术，都极大地扩展了对复杂多细胞生物系统的认知。

图2.单细胞测序技术与空间转录组技术

（图源自网络）

空间转录组技术的前世今生：

空间转录组的一些重要技术可以追溯到20世纪70年代。最先开发出来的smFISH作为原位杂交技术的金标准，可以对某一基因转录组进行原位标记以及定量分析。后续基于单细胞测序以及原位测序技术的空间转录组技术开始出现，逐步提高了空间转录组技术的分辨率，但目前单细胞分辨率与胞内完整转录组信息并不能兼顾。目前，大量的空间转录组技术被开发出来，大致分为基于显微切割、原位杂交（ISH）、原位测序（ISS）和微阵列技术等类型。这些方法各有其优劣势，并寻求实现广泛转录组、高分辨率和高基因检测效率的平衡。

图1 空间转录组研究技术的发展

（图片引自文献[1]）

基于显微切割的空间转录组技术：

显微切割空间转录组技术包括显微切割过程中样品空间位置的设计以及通过基因芯片或RNA-seq对样品转录组的分析。应用最广泛的显微切割技术是LCM，它已被应用于各种生物学领域。利用激光进行目标区域的显微切割，然后将该区域的细胞收集到EP管中进行单细胞测序。其他显微切割技术通常分为机械和光学两类，包括Geo－Seq、NICHE－Seq等。基于LCM技术的优势有：广泛的转录谱、精确的组织切片。缺点有：难以扩大到更大数量的样品，以及存在潜在的RNA降解。

基于原位杂交的空间转录组技术

原位杂交空间转录组技术的原型是2014年的seqFISH，通过将不同颜色的探针与转录本杂交，其中每轮杂交每个基因显示一种颜色，洗去探针用于下一轮杂交条形码中的下一种颜色，推导出当前颜色的相对位置。多轮杂交时，颜色种类越多，组合越多，就能够标记更多的基因。基于smFISH技术的优势有：高基因检测效率，单细胞分辨率和亚细胞转录本定位。缺点包括：只能检测已知的基因，成像时间长，细胞分割较为困难。

基于原位测序的空间转录组技术

基于原位测序（ISS）的方法通过测序产生空间转录组信息，这种方法只依靠连接酶连接两段DNA。在STARmap中，通过一对挂锁探针与组织中的mRNA进行特异性结合，只有特异性结合的探针才可以进行后续的连接，将开口的探针连接后可以进行滚环扩增。水凝胶可以将扩增后的cDNA分子进行原位固定，再使用带有荧光的矫正探针多轮杂交进行Barcode特异性识别。基于ISS技术的优势包括：单细胞分辨率、亚细胞转录物定位和可应用于更大的组织区域。缺点是：检测效率较低。

基于微阵列的空间转录组技术

转录物的空间位置也可以通过从原位阵列上的组织切片中捕获转录物来获取。这种阵列可以通过在商业微阵列载玻片上印刷点条形码、UMIs和多聚T寡核苷酸来捕获多聚腺苷酸化的转录物，如ST和Visium技术。也可以将滴状序列的珠子以单层散布在载玻片上，或限制在载玻片上蚀刻的孔中（例如HDST)。基于阵列技术的优势是：可以应用于大面积的组织。缺点是：没有达到单细胞分辨率，检测效率较低。

图2 不同类型空间转录组技术的原理

（图片引自文献[2]）

空间转录组技术的未来发展：

虽然不同空间转录组分析技术被大量报道，但Visium、ST、Tomo-seq和GeoMX DSP的应用最为广泛。目前这些技术主要被用于表征人类和小鼠组织、肿瘤以及不一定具有定型结构的病理组织。肿瘤组织中的应用可以得到免疫细胞的肿瘤浸润情况、肿瘤微环境以及基因表达差异，这些信息为疾病研究提供了重要的研究方向。目前的技术并不能兼顾单细胞完整转录组信息与空间单细胞分辨率，相信在不久的将来，人类能够完成“人类细胞图谱计划”，绘制好人体细胞的“世界地图”。

参考文献

Asp M, Bergenstrhle J, Lundeberg J. Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration[J]. BioEssays, 2020, 42(10).

Lambda M, Lior P. Museum of Spatial Transcriptomics. bioRxiv, 2021.

《空间转录组技术知多少?》微信公众号贝瑞基因科技服务 ，2021。

来源: 华中科技大学武汉光电国家研究中心